Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1
![Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1](/uploads/covers/2023-12-07/internet-zhurnal-quotdomashnyaya-laboratoriyaquot-2008-1-201.jpg-205x.webp)
- Автор: Журнал «Домашняя лаборатория»
- Жанр: Газеты и журналы / Сделай сам / Хобби и ремесла: прочее
- Дата выхода: 2008
Читать книгу "Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №1"
Свежевыделенные культуры носят название первичных культур до начала пассирования или субкультивирования. Клетки первичной культуры обычно гетерогенны и характеризуются низкой пролиферацией. В них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены. Пассирование обеспечивает возможность продления существования культуры, возможность клонирования, исследования и сохранения свойств клеток. При этом получаются более однородные популяции, а также теряются специализированные клетки. После нескольких пересевов линия клеток либо гибнет, либо трансформируется и становится постоянной клеточной линией. Свойством "бессмертности" обладают в основном клетки, полученные из опухолей. Появление постоянной линии клеток констатируется по морфологическим изменениям (уменьшение размера клеток, снижение их адгезивности, округление, увеличение ядерно/цитоплазматического отношения, по увеличению скорости роста (время удвоения клеток в культуре снижается с 36–48 до 12–36 часов), по снижению зависимости от сыворотки, по увеличению эффективности клонирования, по снижению зависимости от субстрата, по увеличению гетероплоидности (хромосомные различия между клетками) и анеуплоидности и по увеличению опухолеродности. Нормальные клетки могут трансформироваться в постоянную линию, не становясь при этом злокачественными.
Характеристика клеток, культивируемых in vitro
Клетки одного и того же типа в ткани взаимодействуют друг с другом и согласовывают скорость деления, чтобы поддерживать надлежащую плотность популяции. «Социальный» контроль такого рода четко проявляется при реакциях на повреждение. Например, когда поврежден эпителий, клетки по краям раны стимулируются к делению и наползанию на обнаженную поверхность до тех пор, пока она вновь не будет закрыта; в этот момент быстрая пролиферация и движение клеток прекращаются. Сходное явление можно наблюдать на диссоциированных клетках в культуре. Эпителиальные клетки или фибробласты, помещенные в чашку, в присутствии сыворотки будут «приклеиваться» к поверхности, распластываться и делиться до тех пор, пока не образуется сплошной монослой, в котором соседние клетки соприкасаются.
Адгезивные контакты обеспечиваются образованием комплексов из поверхностных рецепторов мембраны клетки. В результате поперечного движения гликопротеидов в мембране образуются электронноплотные бляшки гликопротеиновых комплексов. Такие бляшки формируются в ответ на воздействие антител, агглютинирующих агентов (лектины) или соседних клеток. При адгезии субстрат действует как многовалентное антитело, а образующиеся бляшки называют «адгезивными пятнами». Эти пятна богаты «адгезивными белками» и всегда выделяют элементы цитоскелета, которые удерживают гликопротеиды. Благодаря такому действию уменьшается «разжижение» мембраны, и клетка предохраняется от округления. Образовавшиеся на клетке адгезивные пятна формируют выступы, с помощью которых и происходит перемещение. Выступы цитоплазмы (ложноножки, псевдоподии) при контакте с соседней мембраной ингибируют движение. Клетки в этом случае направляют свои псевдоподии в другом направлении (феномен контактного ингибирования). Когда культура станет монослойной, активность ложноножек и движение клеток прекращается. Нормальные клетки перестают делиться, это явление, известно как торможение пролиферации, зависимое от плотности. Если такой монослой «поранить» иглой таким образом, чтобы на чашке образовалась свободная от клеток полоска, клетки с краев этой полоски начинают продвигаться на свободное место и делиться. Вначале такие явления объясняли только контактным торможением клеточного деления, но это, видимо, не отражает сути дела.
Плотность клеточной популяции, при которой клетки в сплошном монослое перестают делиться, увеличивается с повышением концентрации факторов роста в среде. Кроме того, оказалось, что если культуральная жидкость будет протекать по поверхности чашки с островками клеток, то клетки, омываемые средой, только что прошедшей над другими клетками, будут делиться медленнее, чем те, которые омываются средой, прошедшей над свободными от клеток участками. В среде, протекавшей над клетками, недостает каких-то важных питательных веществ или факторов роста.
Фактор роста обычно присутствует в среде в концентрации около 10-10 М (примерно одна молекула в объеме сферы диаметром 3 мкм). Один фибробласт имеет около 105 рецепторов фактора роста, каждый из которых обладает очень высоким сродством к нему. Таким образом, у каждой клетки достаточно рецепторов, чтобы связать все молекулы ростовых факторов в объеме сферы диаметром около 150
Кроме того, полагают, что значительная часть фактора роста, связанного рецепторами клеточной поверхности, быстро поглощается путем эндоцитоза и разрушается. Из этого ясно, что соседние клетки конкурируют между собой за малейшие количества факторов роста. Такого рода конкуренция важна как для клеток в ткани, так и для культивируемых клеток, она предотвращает рост популяции выше некоторого уровня ее плотности.
Конкуренция за факторы роста и питательные вещества не единственный фактор, влияющий на скорость деления в клеточной культуре. Форма клеток во время их распластывания и движения по поверхности субстрата на свободные места тоже сильно влияет на их способность делиться. При культивировании нормальных клеток в суспензии, когда они не прикреплены к твердой поверхности и поэтому имеют округлую форму, они почти никогда не делятся (зависимость деления от прикрепления). Влияние распластывания клеток на пролиферацию можно продемонстрировать при выращивании клеток на субстратах с различной адгезивностью поверхности или на таких субстратах, где имеются лишь крошечные адгезивные участки, на которых клетка может прикрепиться, но не может распластаться. Частота деления клеток возрастает с увеличением степени их распластывания. Возможно, что сильно распластанные клетки могут улавливать больше молекул фактора роста и поглощать больше питательных веществ благодаря своей большей поверхности.
Однако некоторые типы клеток, почти не способные к пролиферации в суспензии, охотно делятся, как только им удается вступить в контакт с участком субстрата, даже если этот участок настолько мал, что клетка не может на нем распластаться. Такие «фокальные» контакты являются местами соединения (хотя и непрямого) внутриклеточных актиновых филаментов с молекулами внеклеточного матрикса. Эти и другие наблюдения определенно наводят на мысль, что контроль клеточного деления каким-то образом связан с организацией цитоскелета. Хотя механизм и функции этой связи не ясны, можно думать, что зависимость деления клеток от их прикрепления, вероятно, позволяет ткани сохранять целостность и предотвращает пролиферацию клеток, обособившихся от нормального окружения. Цикл прикрепления и открепления, вероятно, позволяет перегруппировать адгезивные контакты как между клетками, так и между клетками и матриксом, чтобы встроить вновь возникшие дочерние клетки в ткань, перед тем как они смогут начать следующий цикл деления. Ослабление контактов, видимо, составляет важную особенность пролиферативного поведения большинства типов клеток. Например, в ранней стадии реакции фибробластов на ростовой фактор отмечается разрушение их фокальных контактов. Потеря управляемости роста у раковых клеток почти всегда связана с необратимым уменьшением клеточной адгезивности, которое проявляется также в потере фокальных контактов при выращивании таких клеток в культуре.
Изменение ростовых свойств культивируемых клеток называется трансформацией. Трансформация — процесс необратимый и, очевидно, включает генетические изменения в той специфической части наследственной информации, которая контролирует неопластический фенотип, добавляемый к трансформированному геному хозяина. Изменение ростовых свойств является одной из адаптивных особенностей, позволяющей клеткам пролиферировать в условиях, неблагоприятных для нетрансформированных клеток. Таким образом, в условиях, которые ограничивают рост нормальных клеток, трансформированные клетки будут расти до более высокой плотности популяции, что, по-видимому, будет связано с их пониженной потребностью в факторах роста. Существуют доказательства, что основное изменение при трансформации связано с изменением транспорта питательных веществ через клеточную мембрану, а это, в свою очередь, может сделать клетки менее зависимыми от «геометрических» факторов роста.
Трансформированные клетки способны расти в условиях, в которых геометрические характеристики, а именно отношение площади поверхности к объему менее благоприятны. Следовательно, трансформированные клетки будут расти в суспензионных культурах, образуя сферические клоны. Так, трансформированные клетки, будучи введенными иммунологически толерантным животным в относительно небольших количествах, могут образовывать опухоли. По этой причине трансформация иногда приравнивается к злокачественным изменениям. Трансформация может быть или вирусной, или «спонтанной». Большинство исследований выполнены с клетками, подвергнутыми вирусной трансформации. Когда при этом использовали хорошо известные трансформирующие вирусы, такие, как вирусы SV40 и полиомы, то свойства трансформированных клеток проявлялись очень наглядно и были описаны подробно. Аналогичные изменения, наблюдавшиеся после спонтанной трансформации, привели к предположению, что такая трансформация является результатом активации последовательностей генов (онкогенов), уже присутствовавших в геноме трансформированной до этого клетки, сходной с таковой в вирусном геноме. Многие исследования подтвердили, что спонтанно трансформированные клетки имеют такую же последовательность оснований в ДНК, как и в клетках, трансформированных вирусами. Но в одной из работ было показано, что аналогичные (может быть, неразличимые) изменения вызываются также точечными мутациями в нормальных генах. Старение характерно для клеток, имеющих ограниченный потенциал пролиферации, то есть низкую плотность насыщения при идеальных условиях культивирования. Примером могут служить линии диплоидных клеток человека. Повышенная способность к росту трансформированных клеток означает, что трансформация преобладает над процессом старения.
Старение, безусловно, зависит от генетических факторов, так как каждый вид имеет характерную продолжительность жизни, но вариабельность внутри популяций по этому показателю свидетельствует также о влиянии фенотипа. При адаптировании диплоидных клеток человека (линия WI38) уже с самого начала было показано, что культивируемые клетки могут проявлять феномен старения и имеют ограниченное время жизни (50±10 удваиваний популяции). Зависящие от возраста изменения, которые при этом наблюдались, включали удлинение межмитотических интервалов (19±25 % — 31±41 %/час), изменение метаболизма, уровней ферментов и экспрессии продукта. Следует отметить, что не установлено четкой связи между продолжительностью жизни в зависимости от происхождения клетки (мышь, человек) и потенциалом удваивания их клеток в культуре.