От оргазма до бессмертия. Записки драг-дизайнера

Поставили на карту

К началу шестидесятых годов прошлого столетия ученые, изучающие молекулы, замороженные до кристаллического состояния, добились выдающегося успеха. Английские кристаллографы и биофизики Макс Перутц и Джон Кендрью установили пространственное строение миоглобина и гемоглобина — важнейших белков, обеспечивающих хранение и транспортировку кислорода в крови. Они использовали рентгеноструктурный анализ — процесс, включающий выращивание кристаллов белков, облучение их потоком рентгеновских лучей и тщательное изучение картины отражения этих лучей от атомов белковых молекул. Оба белка представляли собой совокупности так называемых альфа-спиралей, регулярных структур, в которых каждый четвертый аминокислотный остаток сближен друг с другом. Положение атомов в пространстве было определено с точностью до ангстремов — стомиллионных долей сантиметра. Нобелевскую премию за эту работу Кендрью и Перутц получили в 1962 году.

С тех пор рентгеноструктурная кристаллография добилась колоссальных успехов: трехмерные структуры тысяч белковых молекул уже расшифрованы с помощью этого подхода. Однако против него всегда выдвигалось принципиальное возражение о том, что белок, замороженный в кристалле, может иметь иную пространственную структуру по сравнению с тем же белком в растворе — то есть в организме. Метод же, позволяющий построить конформацию белка вне кристалла по изменениям определенных параметров его атомов под воздействием сильного магнитного поля — ядерный магнитный резонанс (ЯМР), — в те времена был применим лишь к небольшим молекулам. Но после кардинального усовершенствования метода, отмеченного Нобелевской премией 2002 года (Курт Вютрих), трехмерные структуры белков в растворе стало возможным восстанавливать с высокой точностью — и они оказались схожими со структурами тех же белков, полученными рентгеноструктурной кристаллографией. А совсем недавно появился новый подход к проблеме, так называемая криоэлектронная микроскопия: растворы белков замораживают и рассматривают под электронным микроскопом. При этом весьма трудоемкий этап выращивания подходящих для рентгеноструктурного анализа кристаллов исключается, но точность определения положений атомов белков снижается; в самых последних работах, однако, она уже достаточно высока для построения надежных моделей белковых молекул.

Пространственная структура миоглобина, определенная рентгеноструктурным анализом (индекс 1MBN). Слева: схематическое изображение, показывающее ориентацию спиралей; справа: изображение, где однотипные атомы представлены как шарики одного и того же диаметра и того же оттенка

Казалось бы, рентгеноструктурный анализ может без особого труда восстанавливать пространственные структуры молекул пептидов, длина цепочек которых в десятки, а то и в сотни раз меньше, чем у белков. Но нет — выяснилось, что гораздо легче определить пространственное строение длиннейшей белковой молекулы, чем коротенького пептида.

Для понимания этого парадокса вновь обратимся к модели молекулы, состоящей из твердых шариков-атомов, насаженных на жесткие стержни — валентные связи. Атомы внутри молекулы способны взаимодействовать друг с другом — притягиваться и отталкиваться; в первом приближении можно считать, что все пары атомов, которые не связаны жесткими валентными связями, соединены слабыми пружинками. Эти взаимодействия заставляют отдельные части молекулы вращаться вокруг одинарных связей в поисках такого положения, когда межатомные внутримолекулярные пружинки в сумме уравновесят одна другую и конформация молекулы станет устойчивой. Подобные вращения зависят еще и от взаимодействия с соседними молекулами, например с молекулами растворителя.

С увеличением длины цепочки растет и число одинарных связей, то есть возможностей внутримолекулярного вращения; в принципе, чем больше молекула, тем большее количество конформаций для нее может быть доступно. Мерой устойчивости конформаций служит суммарная внутримолекулярная энергия (скажем, степень натяжения межатомных пружинок). Чем ниже уровень такой энергии для молекулы в данной конформации, тем больше вероятность того, что молекула будет существовать в этой конформации. Так вот, молекулы очень многих белков, обладая огромным количеством возможных внутримолекулярных вращений, тем не менее устроены так, что какой-то одной из конформаций — нативной — соответствует энергия гораздо более низкая, чем энергии всех других потенциально устойчивых пространственных структур той же молекулы.

Эта конформация, кроме того, удовлетворяет принципу плотной упаковки, согласно которому в реальных глобулах (еще одно название пространственных структур белков) как можно больше атомов стремятся расположиться поближе друг к другу, а точнее — на взаимных расстояниях, соответствующих максимальным степеням сжатия наших гипотетических межатомных пружинок. В понижение общей внутримолекулярной энергии вносит свой вклад, пусть и очень небольшой, каждая пара взаимодействующих атомов. А поскольку число пар взаимодействий в белке велико, суммарный эффект будет значительным: конформация, более других соответствующая принципу плотной упаковки, окажется в самом выгодном положении. Если же подобных пар мало — как в относительно небольшом пептиде, — то общее понижение энергии не сможет выделить «плотноупакованную» конформацию из прочих, и, следовательно, молекула пептида имеет больше шансов существовать в виде нескольких практически равноправных конформаций. Именно это ограничивает возможности рентгеноструктурного анализа пептидов: понятно, что гибкую молекулу пептида гораздо труднее «заморозить» в кристаллическом виде. И действительно, данных о конформациях пептидов в кристалле сравнительно немного.

С другой стороны, молекула пептида в растворе может постоянно — и быстро — переходить из одной равноправной конформации в другую, а множество пептидных молекул в растворе могут одновременно принимать разные конформации. Поэтому любой экспериментальный метод, измеряющий, например, расстояние между какими-то атомами молекулы в растворе, на выходе даст лишь усредненную величину, которая, вообще говоря, может не относиться ни к одной из этих конформаций в отдельности. (Сходный эффект использует оптический обман, именуемый кинематографом: кадры сменяются так быстро, что мы видим на экране плавный полет птицы, хотя на пленке запечатлены лишь прерывистые отдельные моменты этого полета.)

Этого недостатка экспериментальных методов лишены методы теоретические, расчетные — надо лишь научиться вычислять значения внутримолекулярной энергии, соответствующие каждой из возможных конформаций молекулы. Конформации, обладающие наиболее низкими энергиями, могут считаться наиболее устойчивыми, а конформации с высокими значениями энергии имеют малую вероятность осуществиться, и их можно исключить из рассмотрения. В результате получится не одна «усредненная» пространственная структура, а целый набор стабильных низкоэнергетических конформаций пептидной молекулы. Каждая из них может, в принципе, реализоваться в растворе и внести свой вклад в измеряемую «усредненную» структуру.

Процедура такого расчета и есть теоретический конформационный анализ — наконец-то этот термин получает объяснение, — или, как его иначе называют, конформационные расчеты. Для его проведения не нужны громоздкие и весьма дорогостоящие экспериментальные установки, которые даже в наши дни производятся не массовыми сериями, а по штучным заказам. Нужен лишь компьютер, устройство, достаточно широко распространенное уже полвека назад. Правда, по мощности и быстродействию тогдашние компьютеры были сравнимы разве что с чипами, встроенными в сегодняшние наручные часы.

С таким-то оборудованием некоторые отчаянные головы в разных странах взялись почти одновременно и независимо друг от друга за расчеты внутримолекулярных энергий конформаций аминокислот, пептидов и белков. Предстояло не только разработать удовлетворительные методы вычисления энергии в отдельной конформации, но и справиться с огромным — в перспективе — объемом таких вычислений. Для десятичленного пептида, например, число в принципе возможных конформаций оценивается как 1010 (прописью: десять миллиардов). Теоретический конформационный анализ обязан либо уметь рассчитать энергию каждой из них, либо объяснить, почему данная конформация исключена из рассмотрения.

Минимальный участок змейки Рубика, позволяющий сделать линейную цепочку трехмерной, — это две жесткие призмы, соединенные шарниром. Точно так же минимальный фрагмент пептидного остова, способный к конформационным изменениям, — аминокислотный остаток, две пептидные группы, соединенные центральным атомом углерода (его еще называют Сα; символ Сβ обозначает первый из атомов боковой цепи).

Схематическое изображение типичного аминокислотного остатка

В этом фрагменте может быть лишь два угла вращения: вокруг связей N — С (φ) и Сα — С (ψ); связь С — N не одинарная, а так называемая полуторная, и угол вращения вокруг нее почти всегда равен 180°, что обеспечивает максимальное удаление двух атомов Сα, входящих в состав пептидной группы. Повороты соседних элементов змейки Рубика друг относительно друга ограничены возможностями шарниров между ними; взаимные вращения соседних пептидных групп тоже ограничены. Рассчитав сумму энергий взаимодействий между всеми атомами аминокислотного остатка, можно построить его конформационную карту — таблицу значений внутримолекулярной энергии для каждой пары значений углов поворота φ и ψ.

Первая такая карта была рассчитана в 1963 году в Индии группой под руководством Г. Н. Рамачандрана для как можно более простой модели молекулы. Предполагалось, что атомы-шарики абсолютно твердые, а длины валентных связей и величины валентных углов фиксированны; вычисления проводились на обыкновенном настольном калькуляторе. На «карте Рамачандрана» фигурировали лишь два типа конформаций аминокислотного остатка (они же пары величин φ и ψ): «запрещенные» (сферы хоть одной пары шариков пересекаются) и «разрешенные» (ни одного пересечения нет).

Несмотря на все упрощения, карта хорошо объясняла известные к тому времени данные рентгеноструктурного анализа. Именно точки, соответствующие парам углов φ и ψ, полученным по атомным координатам белков и пептидов, найденным в эксперименте, ложились в «разрешенные», а не «запрещенные» области карты Рамачандрана. Правда, по мере появления новых экспериментальных пространственных структур белков стало ясно, что некоторые точки попадают и в «запрещенные» области. Но прецедент был создан: было показано, что даже грубые и заведомо неточные расчеты в какой-то степени отражают реальные конформационные возможности белков.

Уточнения модели начались с того, что взаимодействие между парами атомов («пружинка») было представлено в виде функции, зависящей от межатомного расстояния («потенциальная функция»). Эта функция должна была иметь максимум при минимальном расстоянии — когда твердые шарики перекрылись бы, — переходить к нулевому значению на больших расстояниях и иметь слабый минимум где-то в промежутке. Параметры функции зависят от типа пары взаимодействующих атомов и могут быть определены либо эмпирически, по физическим свойствам газов и кристаллов, либо получены из подробных квантовомеханических расчетов.